細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)建于二十世紀(jì)初，歷經(jīng)一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，現(xiàn)在已成為生命科學(xué)領(lǐng)域越來(lái)越重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。由于細(xì)胞的特殊性，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，或在細(xì)胞建株和建系過(guò)程中，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的各種生物特性都會(huì)逐漸發(fā)生變化。因此，原始細(xì)胞種子的及時(shí)保存就顯得尤為必要。在雜交瘤單抗的制備過(guò)程中，雜交瘤細(xì)胞以及克隆化得到的亞克隆細(xì)胞的凍存，是bi不可少的操作。因?yàn)樵跊](méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系或穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，在細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能因細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失或遺傳變異等等緣故而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，如果沒(méi)有原始細(xì)胞的凍存，則將因?yàn)樯鲜龅囊馔舛肮ΡM棄。除此之外，購(gòu)買(mǎi)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞也需要利用細(xì)胞凍存的形式來(lái)進(jìn)行。因此，及時(shí)方便地進(jìn)行細(xì)胞的凍存在實(shí)際工作中顯得十分必要。

細(xì)胞凍存要取得好的效果，多采用血清、甘油或二甲基亞砜(DMSO)等作為保護(hù)劑，最大限度的保存細(xì)胞活力。這些物質(zhì)有些能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，在緩慢冷凍過(guò)程中可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。同時(shí)，有些保護(hù)劑在細(xì)胞外也能減輕溶液中高濃度溶質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步避免細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中受到損傷。滲透性保護(hù)劑DMSO和非滲透性保護(hù)劑血清(主要含白蛋白)是使用最為廣泛，效果最為穩(wěn)定可靠的。

此外，采用“慢凍快融"的方法能較好地保證細(xì)胞存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開(kāi)始為-1到-2℃/分鐘，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。復(fù)蘇細(xì)胞采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

現(xiàn)有凍存方法存在的問(wèn)題:

1、DMSO對(duì)細(xì)胞存在一定的毒性，用量受到限制，降低或者不使用DMSO，尋找其它替代物是最hao的選擇。但是目前，該技術(shù)領(lǐng)域還未發(fā)現(xiàn)凍存保護(hù)效果能與DMSO媲美的物質(zhì)，因此，聯(lián)合其它成分，形成新的配方，降低DMSO的含量就成了較為現(xiàn)實(shí)的選擇。

2、血清，即使是純化得到的白蛋白，由于其動(dòng)物來(lái)源的特性，會(huì)極大增加帶來(lái)病毒等感染物質(zhì)的可能。而且，血清來(lái)源受限，價(jià)格昂貴，所以其使用也必然會(huì)受到越來(lái)越多的限制。因此，尋找替代血清的非滲透性保護(hù)劑也顯得尤為必要。

3、目前，zui成熟和zui穩(wěn)定的凍存細(xì)胞技術(shù)是將加有保護(hù)劑的細(xì)胞懸液置于-196℃液氮中，這樣可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而保持細(xì)胞的特性，在需要的時(shí)候經(jīng)過(guò)復(fù)蘇程序，使得細(xì)胞重新生長(zhǎng)增殖以用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞儲(chǔ)存在-196℃液氮中，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的，但是液氮凍存步驟繁瑣，需要經(jīng)過(guò)程序降溫，如先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘，然后移至-20℃冰箱30分鐘，再移至-80℃冰箱保存16-18個(gè)小時(shí)(或隔夜)，最后才移至液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期的儲(chǔ)存。(其中需要注意的是-20℃條件下不可超過(guò)1個(gè)小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量的死亡。)

市面上“無(wú)血清細(xì)胞凍存液"獲得了廣大科研工作者的喜愛(ài)。 而本公司提供的一種新的凍存液體系: 無(wú)血清低DMSO細(xì)胞凍存液78EC10001，不僅可以省卻對(duì)血清的使用，而且還顯著降低了DMSO的用量。同時(shí)，本專li細(xì)胞凍存液凍存的細(xì)胞懸液可以直接放置于-80℃冰箱，既不需要繁瑣的程序降溫或采用程序降溫儀，更不需要放置在-196℃液氮中，節(jié)省了大量時(shí)間和精力。該細(xì)胞凍存液通用于人和各種動(dòng)物細(xì)胞株。特別配方(主要成分為5% DMSO和氨基酸)具有有效提高細(xì)胞凍存活率和復(fù)蘇活力。不含血清及動(dòng)物來(lái)源性蛋白，能減少各類病毒、霉菌和支原體等的污染，確保凍存細(xì)胞安全。既適用于一般培養(yǎng)細(xì)胞的凍存，也適用于無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞和蛋白表達(dá)細(xì)胞的凍存。

產(chǎn)品特點(diǎn):

1. 高安全性，不含血清及動(dòng)物源成分，病毒、霉菌和支原體等污染可能性低，各批產(chǎn)品之間有更高的產(chǎn)品質(zhì)量一致性。

2. 低DMSO，DMSO的含量為10%(v/v)，極大降低了對(duì)細(xì)胞潛在的毒性作用。

3. 細(xì)胞存活率高，無(wú)批次差異。

4. wan全凍存液配方，可直接使用，方便簡(jiǎn)捷。

5. 可直接存放于-80℃冰箱凍存，無(wú)需經(jīng)過(guò)費(fèi)時(shí)的程序降溫過(guò)程(省時(shí)、省力、省錢(qián))，不需要采用程序降溫儀，更不需要放置在-196℃液氮。

6. 可原位凍存，比如雜交瘤細(xì)胞的亞克隆，可以大規(guī)模減少工作量，避免污染。

凍存效果對(duì)比:

圖1. 小鼠成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)對(duì)比圖

對(duì)照B:存活率89% 本產(chǎn)品:存活率97%

圖2. 人胚腎細(xì)胞293E細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)對(duì)比圖

對(duì)照B:存活率86% 本產(chǎn)品:存活率93%

注:對(duì)照A: DMEM培養(yǎng)基+10%血清+10%DMSO，液氮凍存;

對(duì)照B: 無(wú)血清細(xì)胞凍存液(DMSO 10% v/v);

附:通用細(xì)胞凍存液，無(wú)血清細(xì)胞凍存液、無(wú)血清低DMSO細(xì)胞凍存液的比較